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 　　由于腫瘤是復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，3D腫瘤球體模型成為模擬腫瘤血管生成或轉(zhuǎn)移等生理學(xué)相關(guān)腫瘤微環(huán)境的相關(guān)模型系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)方案詳細(xì)闡述了使用 µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片(貨號(hào)：80376)將腫瘤球狀體包埋在I型膠原凝膠與內(nèi)皮細(xì)胞（人臍靜脈細(xì)胞，HUVECs）中進(jìn)行共培養(yǎng)。該模型還可以通過(guò)灌流培養(yǎng)技術(shù)來(lái)模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件。

　　

　　ibidi為球狀體和類器官灌注培養(yǎng)提供多種解決方案：

　　

　　• µ-Slide III 3D Perfusion 

　　

　　• µ-Slide Spheroid Perfusion 

　　

　　• µ-Slide I Luer 3D 

　　

　　• µ-Slide With Multi-Cell µ-Pattern ibiTreat 

　　

　　• ibidi Collagen Type I 

　　

　　• ibidi Pump Systems and Accessories

　　

　　

　　相關(guān)文件:

　　

　　• Application Note 13: Endothelial Cells Under Perfusion 

　　

　　• Application Note 16 Immunofluorescence Staining Using the µ-Slide 8 Well high 

　　

　　• Application Guide 34: Cell Culture Under Flow 

　　

　　關(guān)鍵詞：3D培養(yǎng)模型、腫瘤微環(huán)境、3D共培養(yǎng)；內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤球狀體、腫瘤血管生成

　　

　　1、實(shí)驗(yàn)材料

　　

　　注意：本方案針對(duì)Hep-G2腫瘤細(xì)胞球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化；使用其他細(xì)胞球狀體或內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)調(diào)整試劑和緩沖液。

　　

　　1.1 試劑和緩沖液

　　

　　·人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，12203，Promocell 公司）

　　

　　·腫瘤細(xì)胞球狀體（如 Hep-G2 Leibniz-Institut DSMZ, ACC 180）

　　

　　·內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（Promocell，C-22010）

　　

　　·內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基 2（Promocell，C-22011）

　　

　　·PBS (14190144, Gibco)

　　

　　·Accutase細(xì)胞解離液（A1110501，Gibco）

　　

　　·I型膠原蛋白 、大鼠尾部（ibidi，50201）或牛（ibidi，50301），非胃蛋白酶化，5 mg/ml在17.5 mM或0.1M 酸中稀釋至4 mg/ml

　　

　　·17.5 mM和0.1 M乙酸

　　

　　·10x DMEM（Sigma，D2429）

　　

　　·1x DMEM（Sigma，D5796）

　　

　　·培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（如L-谷氨酰胺，視細(xì)胞類型而定）

　　

　　·1M超純水中的NaOH

　　

　　·7.5%碳酸氫鈉（Sigma，S8761）

　　

　　·無(wú)菌超純水

　　

　　

　　1.2 設(shè)備與耗材

　　

　　·µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片(80376)

　　

　　·ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)(10902)含一套灰色灌注管套裝(10968)

　　

　　·標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（超凈工作臺(tái)、細(xì)胞解離試劑盒、培養(yǎng)瓶、移液器、吸頭等）

　　

　　·倒置顯微鏡

　　

　　·冰塊和冷卻架

　　

　　重要提示：為避免產(chǎn)生氣泡，灌注裝置和培養(yǎng)基的脫氣至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天將以下部件放入培養(yǎng)箱中。只要不打開(kāi)包裝，就能保持無(wú)菌狀態(tài)。   

 

　　• 灌注裝置（在包裝內(nèi)）   

　　

　　 • 用于細(xì)胞接種的細(xì)胞培養(yǎng)基（在小容器中加入所需體積的培養(yǎng)基，并稍微松開(kāi)蓋子）由于氣體在水和塑料中的溶解度與溫度有關(guān)，因此有必要采用這一程序。在較高溫度下，水和塑料吸收的氣體比在較低溫度下少。

　　

　　2、制備含球狀體的3D凝膠

　　

　　在無(wú)菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。

　　

　　重要提示：此共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的下一步需要先前生成的球狀體。用于生成球狀體的一些ibidi解決方案有µ-Slide Spheroid Perfusion(ibidi, 80350)。如需了解生成細(xì)胞球狀體的詳細(xì)步驟，請(qǐng)參閱ibidi Labware Application Note 63：Generation and Dynamic Culture of L929 Spheroids in the µ-Slide Spheroid Perfusion，或Bioinert ULA超低吸附表面系列產(chǎn)品(ibidi 81150, 80800 and 80420)

　　

　　1.用5µg/cm I型膠原蛋白（牛尾或大鼠尾，取決于所需的凝膠）預(yù)涂培養(yǎng)孔。涂上18µl 0.07µg/µl I型膠原蛋白溶液，在室溫下孵育1小時(shí)。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，用PBS輕輕清洗。

　　

　　注意：此步驟對(duì)于防止3D凝膠脫落至關(guān)重要。因此，重要的是用H2O或PBS將I型膠原稀釋至0.07µg/µl的最終濃度。

　　

　　2.取出先前生成的球狀體（例如，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用µ-Slide Spheroid Perfusion球體灌注通道載玻片）并在室溫下將其收集到層流罩下的試管中。

　　

　　3.如果凝膠基質(zhì)中需要補(bǔ)充劑，可將其添加到1x細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將其置于層流罩中的冰塊上。

　　

　　4.將所有其他成分和一個(gè)容量足以容納凝膠總量的無(wú)菌試管放在層流罩的冰上。拆開(kāi)載玻片的包裝，將其也放入層流罩中。

　　

　　5.用移液管將除膠原蛋白和細(xì)胞懸浮液外的所有成分按表1和表2所列順序移入試管中，并將其置于冰上。通過(guò)上下移液混合，然后放回冰上。

　　

　　移取膠原凝膠的重要注意事項(xiàng)

　　

　　移取凝膠時(shí)一定要使用預(yù)冷移液器吸頭（4°C）。

　　

　　制備膠原蛋白I凝膠基質(zhì)時(shí)，由于粘度較高，建議所有步驟都采用反向移液。將移液器按壓至第二個(gè)壓力點(diǎn)，將凝膠注入整個(gè)移液器吸頭。僅在達(dá)到第一個(gè)壓力點(diǎn)之前分配凝膠。這樣移液器吸頭中會(huì)有殘留的凝膠需要丟棄，但體積會(huì)更加精確。另外，您也可以使用專為高粘度溶液設(shè)計(jì)的移液器。我們推薦使用EppendorfVisco吸頭或Gilson Microman E吸頭。

　　

　　注意：即使在4°C溫度下，凝膠混合物也最多可使用5分鐘，然后會(huì)出現(xiàn)部分凝膠化。

　　

　　6.確保I型膠原蛋白,鼠尾膠原蛋白在17.5 mM乙酸中稀釋至4.0 mg/ml，牛尾膠原蛋白在0.1 M乙酸中稀釋至4.0 mg/ml。請(qǐng)查看分析證書(shū) (CoA)，以了解特定批次的膠原蛋白濃度。

　　

　　注意：在稀釋膠原蛋白之前，必須用移液管上下移動(dòng)幾次，使其充分混合，以形成均勻的溶液。

　　

　　7.將膠原蛋白加入步驟5中制備的混合物中。用移液管充分混合，同時(shí)始終將試管置于冰上。

　　

　　8.將制備好的球體懸液加入混合物中。盡量在50µl的體積內(nèi)收集盡可能多的球形體。然后，短暫渦旋混合樣品。

　　

　　9.現(xiàn)在可以將混合物移入µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片。移液過(guò)程中，請(qǐng)將載玻片片放在冰上。

　　

　　提示：為避免因冰而劃傷，請(qǐng)將µ-Side放入培養(yǎng)皿中，然后將帶有玻片的培養(yǎng)皿放在冰上。

　　

　　10.取下載玻片上側(cè)的保護(hù)膜，在每個(gè)孔中注入30 µl液體凝膠。避免產(chǎn)生氣泡。

　　

　　

　　使用µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片灌注的實(shí)驗(yàn)流程示意圖

　　

　　11.然后，將蓋玻片放在載玻片的粘性部分。按壓蓋玻片以確保粘合區(qū)域密封嚴(yán)實(shí)。

　　

　　12.用隨附的蓋子蓋住Luer魯爾接頭以保持無(wú)菌，然后將裝有凝膠的載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5% CO² ）中培養(yǎng)45分鐘，使其凝膠化。

　　

　　13.凝膠化后，用10倍物鏡進(jìn)行相差顯微鏡觀察，可以看到膠原纖維。

　　

　　

　　表 1：使用I型膠原蛋白、鼠尾和 DMEM 制作凝膠的移液方案。所有成分均按移液順序排列。

　　

　　

　　表 2：使用牛膠原I和DMEM制備凝膠的移液方案。所有成分均按移液順序排列。

　　

　　3、內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞接種

　　

　　在無(wú)菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。

　　

　　1.在開(kāi)始使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)開(kāi)始灌注前,請(qǐng)?jiān)?7°C的培養(yǎng)箱中預(yù)熱Perfusion Set灌流裝置和內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基（ECGM  和 ECGM 2）。

　　

　　2.用Accutase處理HUVEC 1-2分鐘，使其脫離。

　　

　　3.收集細(xì)胞懸浮液，然后離心并用少量培養(yǎng)基（ECGM）稀釋，以便計(jì)數(shù)。

　　

　　4.計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將其調(diào)整到培養(yǎng)基中2×106 cells/ml的最終濃度。

　　

　　5.在每個(gè)通道中加入約70 µl細(xì)胞懸液。從魯爾接頭中取出剩余的細(xì)胞懸液，重復(fù)接種步驟以提高細(xì)胞均勻度。

　　

　　6.用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭從魯爾適配器中移除剩余的細(xì)胞懸液，并用提供的蓋子蓋住載玻片以保持無(wú)菌。

　　

　　7.將載玻片連同無(wú)菌濕巾放入培養(yǎng)皿中，然后其放入（37°C, 5% CO²）細(xì)胞培養(yǎng)箱中。8.在靜態(tài)培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)基必須每2-3天更換一次。

　　

　　4、連接ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌注

　　

　　重要提示: 內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基2含有誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和發(fā)芽的生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子。

　　

　　1.在細(xì)胞培養(yǎng)期間，按ibidi Pump System中的說(shuō)明準(zhǔn)備ibidi Pump System。將ECGM2培養(yǎng)基注入儲(chǔ)液池。

　　

　　2.孵育2小時(shí)后，將載玻片連接到灌注系統(tǒng)，并注入ECGM2培養(yǎng)基。

　　

　　3.如需進(jìn)行延時(shí)系列成像，將載玻片放入顯微鏡載物載物臺(tái)的孵育箱（如ibidi Stage Top Incubator加熱孵育系統(tǒng)/臺(tái)式培養(yǎng)箱)并開(kāi)始延時(shí)成像。如需單幀成像，請(qǐng)?zhí)崆霸O(shè)置好顯微鏡參數(shù)，以盡可能縮短成像時(shí)間。不成像時(shí)，將載玻片放回培養(yǎng)箱。若要進(jìn)行終點(diǎn)分析，請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)固定細(xì)胞，然后繼續(xù)染色（見(jiàn)本文「染色」章節(jié))或執(zhí)行下游方案。

　　

　　

　　灌注培養(yǎng)條件下的延時(shí)成像實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

　　

　　5、活細(xì)胞相差成像示例

　　

　　

　　灌注條件下共培養(yǎng)5天的相差圖像，顯示聚焦的球狀體（左）和聚焦的HUVEC細(xì)胞（右）（I 型膠原鼠尾凝膠）

　　

　　

　　灌注條件下共培養(yǎng)5天的相差圖像，顯示聚焦的球狀體（左）和聚焦的HUVEC細(xì)胞（右）（I 型牛膠原凝膠）

　　

　　6、染色

　　

　　6.1 材料

　　

　　•PBS (14190144, Gibco)

　　

　　•10%福爾馬林，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

　　

　　•Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體，MA5-18135 Invitrogen）

　　

　　•Phalloidin-iFluor 647試劑（ab176758，Abcam ）

　　

　　•4′,6-diamidino-2-phenyl-indole （DAPI）（D9542 Sigma Aldrich）

　　

　　•Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）

　　

　　•破膜緩沖液（0.5% Triton X-100 加入 PBS）

　　

　　•封閉緩沖液（1% BSA + 0.2% Triton X-100 in PBS）

　　

　　•抗體稀釋緩沖液（PBS 中含 1% BSA + 0.05% Triton X-100）

　　

　　•牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G，Sigma Aldrich）

　　

　　6.2 染色步驟

　　

　　1.為實(shí)驗(yàn)制備充足的破膜緩沖液和封閉緩沖液。

　　

　　2.斷開(kāi)載玻片與泵之間的連接。

　　

　　3.從Luer魯爾接頭處吸出細(xì)胞培養(yǎng)液。

　　

　　4.在一個(gè)Luer魯爾接扣注入100 µl PBS，輕輕清洗細(xì)胞兩次，直到看到液體從另一個(gè)魯爾接口流出。

　　

　　5.用福爾馬林（10%）代替PBS固定細(xì)胞。首先，從 Luer 端口移除PBS，然后在一個(gè)Luer端口加入100 µl福爾馬林，再?gòu)牧硪粋€(gè)Luer端口移除。然后，再次加入100 µl福爾馬林并孵育15分鐘。

　　

　　6.去除福爾馬林，用100 µl PBS沖洗細(xì)胞四次。

　　

　　7.在100 µl破膜緩沖液中孵育細(xì)胞10分鐘（用破膜緩沖液交換PBS，類似于步驟 5--福爾馬林交換）。

　　

　　8.去除破膜緩沖液，用100 µl PBS沖洗細(xì)胞兩次。

　　

　　9.用100 µl封閉緩沖液（像使用福爾馬林一樣將PBS與封閉緩沖液交換）封閉30分鐘。

　　

　　10.在封閉緩沖液步驟中，準(zhǔn)備足夠的抗體稀釋緩沖液來(lái)稀釋一抗和二抗。

　　

　　11.用抗體稀釋緩沖液稀釋標(biāo)記抗體（或一抗）（1:100 稀釋度）。

　　

　　12.用100 µl一抗溶液置換封閉緩沖液，然后在4°C孵育細(xì)胞過(guò)夜。

　　

　　13.從這時(shí)起，樣品應(yīng)盡可能保存在黑暗中。

　　

　　14.用100 µl封閉緩沖液清洗三次。

　　

　　15.用相同的抗體稀釋緩沖液稀釋（第二抗體和）類熒光素及DAPI（類熒光素 647 結(jié)合物 1:1000 稀釋，DAPI 10 µg/ml）。

　　

　　16.用100 µl的二次染色液更換封閉緩沖液，并在黑暗中孵育過(guò)夜。

　　

　　17.用100 µl封閉緩沖液清洗三次。

　　

　　18.用PBS更換封閉緩沖液（每個(gè)通道100 µl）

　　

　　19.成像前保存在4°C黑暗處。最好立即進(jìn)行成像，因?yàn)榇娣艜r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低成像質(zhì)量。

　　

　　7、染色共培養(yǎng)的圖像示例

　　

　　

　　在灌注條件下共培養(yǎng)3天后，對(duì)球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動(dòng)蛋白絲：Phalloidin-iFluor 647（紅色）；CD31（對(duì)HUVEC特異性）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色），（I 型膠原大鼠尾部凝膠）。

　　

　　

　　在灌注條件下共培養(yǎng)3天后，對(duì)球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動(dòng)蛋白絲：Phalloidin-iFluor 647（紅色）；CD31（對(duì)HUVEC特異性）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色），（I型膠原牛凝膠）。