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 　　血管形成實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單但功能強(qiáng)大的體外工具，用于篩選抗血管生成或促血管生成作用的物質(zhì)。這些影響可以通過(guò)不同的參數(shù)來(lái)測(cè)量，例如管的長(zhǎng)度或凝膠表面形成的環(huán)的數(shù)量。

　　初始步驟通常涉及創(chuàng)建一個(gè)基底膜狀凝膠基質(zhì)作為生長(zhǎng)區(qū)域(例如，通過(guò)使用Laminin-Collagen I或Matrigel®)。接下來(lái)，將細(xì)胞接種在固化的凝膠基質(zhì)上，然后進(jìn)行孵育并使用光學(xué)顯微鏡采集圖像數(shù)據(jù)。隨著時(shí)間的推移，測(cè)量管的形成參數(shù)提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)，可以揭示添加抗血管生成或促血管生成物質(zhì)后管的形成特性的變化。

　　優(yōu)化成管分析的實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)采集方法對(duì)于獲得可靠和可重復(fù)的數(shù)據(jù)至關(guān)重要，這是正確分析的先決條件。本應(yīng)用說(shuō)明概述了重要的分析參數(shù)和規(guī)劃有效血管形成分析的指南。

　　1、規(guī)劃實(shí)驗(yàn)

　　在開(kāi)始管形成和血管生成分析之前，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)測(cè)試確定較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)設(shè)置至關(guān)重要。所選擇的系統(tǒng)應(yīng)與研究目標(biāo)密切一致，并允許可行的數(shù)據(jù)收集。因此，建立嚴(yán)格的方案對(duì)于生成可重復(fù)和可比較的數(shù)據(jù)集至關(guān)重要。

　　在管形成和血管生成實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵因素包括細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞密度、生長(zhǎng)培養(yǎng)基、凝膠基質(zhì)和數(shù)據(jù)采集時(shí)間點(diǎn)。這些因素將在接下來(lái)的章節(jié)中進(jìn)一步討論。

　　在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，計(jì)算所需的材料，如培養(yǎng)基、凝膠基質(zhì)、物質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室器具和細(xì)胞數(shù)的數(shù)量。其他需要考慮的因素包括實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、空間要求和時(shí)間安排。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都應(yīng)該在相同的細(xì)胞培養(yǎng)和環(huán)境參數(shù)下進(jìn)行。

　　為了進(jìn)行可靠的統(tǒng)計(jì)分析，我們建議每種情況至少有4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，每種情況至少有8個(gè)單獨(dú)的孔。這導(dǎo)致總共至少32個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的次數(shù)取決于數(shù)據(jù)的同質(zhì)性。在計(jì)算耗材、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理時(shí)間時(shí)，應(yīng)考慮這一點(diǎn)。

　　1.1 細(xì)胞類(lèi)型和傳代次數(shù)

　　不同的細(xì)胞類(lèi)型在大小、生長(zhǎng)行為(擴(kuò)散、加倍率)和對(duì)生長(zhǎng)條件的要求上各不相同。例如，細(xì)胞大小決定細(xì)胞播種數(shù)以調(diào)整細(xì)胞密度。此外，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分可以影響促血管生成或抗血管生成作用。

　　此外，傳代次數(shù)(P)可以影響原代細(xì)胞的行為和功能，原代細(xì)胞通常用于管形成試驗(yàn)。低傳代細(xì)胞(<P6)更具有生理相關(guān)性。然而，在較高的傳代中，細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷增殖能力的喪失，基因表達(dá)的改變和形態(tài)的改變，會(huì)影響結(jié)果。

　　一個(gè)成熟可靠的實(shí)驗(yàn)設(shè)置是使用低傳代(<P6)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，在不含生長(zhǎng)因子和2%或更低血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

　　1.2 培養(yǎng)基成分

　　細(xì)胞培養(yǎng)基是管形成試驗(yàn)中的一個(gè)重要因素，提供關(guān)鍵的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并影響細(xì)胞行為。選擇優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基可確保細(xì)胞健康，并能準(zhǔn)確反映生物過(guò)程。生長(zhǎng)因子濃度和血清含量等因素在這一選擇中至關(guān)重要。

　　在培養(yǎng)基中加入血清可能會(huì)影響管的形成行為——在大多數(shù)情況下，血清會(huì)抑制管的形成。為了避免這個(gè)問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)使用1.3節(jié)中定義的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞密度測(cè)試0-20%的不同血清濃度。這將決定管形成和細(xì)胞存活的優(yōu)質(zhì)血清濃度。

　　1.3 細(xì)胞密度

　　凝膠表面的細(xì)胞數(shù)量是獲得管形成試驗(yàn)可靠結(jié)果的關(guān)鍵參數(shù)。要確定優(yōu)質(zhì)細(xì)胞播種密度，請(qǐng)記錄細(xì)胞系的特性。

　　首先，在 5–40 × 103個(gè)細(xì)胞/ml的范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋。然后將細(xì)胞接種到凝膠表面。接種后，開(kāi)始以30分鐘的時(shí)間間隔記錄相位對(duì)比圖像。理想情況下，每個(gè)細(xì)胞濃度執(zhí)行3-5次重復(fù)。

　　按照第3節(jié)的描述對(duì)圖像進(jìn)行評(píng)估。在這里，我們建議使用較常見(jiàn)的關(guān)鍵參數(shù)“總管長(zhǎng)”。在您選擇的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(例如，4小時(shí)后)，在下圖中可視化細(xì)胞播種密度與管長(zhǎng)度的關(guān)系。數(shù)據(jù)將顯示一個(gè)具有較大值的特征曲線，這是所使用細(xì)胞類(lèi)型的優(yōu)質(zhì)播種密度。。此處所示的示例使用HUVEC，其優(yōu)質(zhì)播種密度為 10–20 × 103個(gè)細(xì)胞/ml。

HUVEC播種密度響應(yīng)的示例性。該圖顯示了在播種后4小時(shí)隨細(xì)胞播種密度變化的分析管長(zhǎng)。

　　1.4 陽(yáng)性和陰性對(duì)照

　　在管生成實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合控制對(duì)于獲得有意義、可靠的結(jié)果至關(guān)重要。

　　應(yīng)使用刺激管形成的陽(yáng)性對(duì)照來(lái)建立對(duì)生物活性物質(zhì)反應(yīng)的參考值。為了建立陽(yáng)性對(duì)照，選擇一個(gè)確保管形成的實(shí)驗(yàn)環(huán)境(例如，用于HUVECs的Matrigel®低生長(zhǎng)因子和無(wú)血清培養(yǎng)基)。陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證細(xì)胞的生命狀況，并作為任何促血管生成或抗血管生成物質(zhì)的參考。陰性對(duì)照確保在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中可以抑制管的形成。為了建立陰性對(duì)照，選擇一種被證明對(duì)管狀形成有抑制作用的物質(zhì)(例如，用于HUVECs的蘇拉明)。

　　1.5 凝膠基質(zhì)

　　用于管形成測(cè)定的凝膠用作基底膜樣（BM）表面，以模擬體外的自然條件。然而，凝膠的生化和機(jī)械性能顯著影響細(xì)胞行為，并影響管的形成。

　　用于管形成分析的先進(jìn)凝膠是Matrigel®或Laminin膠原蛋白I凝膠。兩種凝膠都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，在規(guī)劃實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該考慮到這一點(diǎn)。

　　Matrigel®是一種從Engelbreth Holm Swarm小鼠肉瘤中提取的天然即用型BM溶液。然而，一個(gè)缺點(diǎn)是癌癥環(huán)境中生長(zhǎng)因子的定義不清且成分可變。這導(dǎo)致不同批次之間的機(jī)械和生化性能波動(dòng)，從而改變管的形成特性。因此，當(dāng)使用Matrigel®時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)都應(yīng)使用同一批次的Matrigel®進(jìn)行。

　　相比之下，雙組分層粘連蛋白-膠原I凝膠被認(rèn)為具有更明確的基質(zhì)組成。但是，它并不包括BM的所有天然成分。

　　2、成像

　　成像在管形成分析中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)樗梢栽敿?xì)觀察和分析血管生成效應(yīng)。通常，相差顯微鏡用于可視化細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，而不需要染色。管形成分析即可以作為時(shí)間序列進(jìn)行，以確定形成的動(dòng)態(tài)行為，也可以作為終點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，在一定時(shí)間后固定細(xì)胞進(jìn)行成像。

　　2.1 選擇優(yōu)質(zhì)的物鏡

　　由于管的形成是在整個(gè)載玻片孔的表面區(qū)域，因此建議觀察盡可能大的視場(chǎng)角(FOV)建議，以獲得較大的信息量。FOV可以通過(guò)改變物鏡的放大倍數(shù)來(lái)改變——使用4x到10x物鏡的低放大倍率對(duì)于大多數(shù)管形成實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)是足夠的。

　　Tips：視場(chǎng)(FOV)與圖像分辨率間接相關(guān)。使用低倍率物鏡（2-10倍）將導(dǎo)致低分辨率的大視場(chǎng)。相比之下，使用高倍率物鏡(20倍或更高)將導(dǎo)致較低的視場(chǎng)，但具有較高的分辨率。

　　如果需要高分辨率的大視場(chǎng)，建議采集后對(duì)單幅圖像進(jìn)行拼接掃描。

　　2.2 延時(shí)成像對(duì)于延時(shí)成像和活細(xì)胞成像，需要維持一個(gè)穩(wěn)定的生理環(huán)境，以確保細(xì)胞的自然行為，使用ibidi Stage Top Incubators可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在凝膠表面播種細(xì)胞后，立即將載玻片或培養(yǎng)皿置于顯微鏡上適當(dāng)?shù)姆跤抑?，并開(kāi)始時(shí)間序列?？赡苄枰獙?duì)每個(gè)時(shí)間步驟進(jìn)行焦點(diǎn)調(diào)整，這可以手動(dòng)或使用基于軟件的工具完成。

　　如果您的顯微鏡沒(méi)有孵育室，請(qǐng)?jiān)讷@取圖像后立即將樣品放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在這種情況下，盡量縮短成像時(shí)間（例如，盡量縮短培養(yǎng)箱和顯微鏡之間的距離），以避免樣品中的溫度波動(dòng)。

　　在進(jìn)行延時(shí)成像時(shí)，時(shí)間間隔和總成像時(shí)間取決于所使用的細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)條件。例如，第一種方法可能是在24小時(shí)內(nèi)以15-30分鐘的時(shí)間步長(zhǎng)進(jìn)行成像。然后，應(yīng)該調(diào)整第一次實(shí)驗(yàn)的時(shí)間序列參數(shù)，以找到較優(yōu)的時(shí)間步長(zhǎng)。因此，通過(guò)可視化一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)(例如，管總長(zhǎng)度，見(jiàn)第3節(jié))與時(shí)間的關(guān)系來(lái)分析時(shí)間序列，如下圖所示。該參數(shù)的時(shí)間曲線與細(xì)胞有關(guān)，這里展示了在Matrigel®上生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞的示例。在這里，時(shí)間曲線通常上升到緩慢平坦(>20小時(shí))。應(yīng)定義一個(gè)信號(hào)高且穩(wěn)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。在下面的例子中，當(dāng)使用在Matrigel®上生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞時(shí)，建議的測(cè)量時(shí)間點(diǎn)在4到5小時(shí)之間。

　　在Matrigel®上以15分鐘的時(shí)間間隔生長(zhǎng)超過(guò)24小時(shí)的HUVEC細(xì)胞的時(shí)間序列。這里，從每個(gè)時(shí)間步長(zhǎng)計(jì)算出作為管形成代表參數(shù)的總管長(zhǎng)度。該參數(shù)的曲線通常會(huì)上升到較大值（此處為~4小時(shí)），然后下降到平穩(wěn)階段（此處為~7小時(shí)后），逐漸緩慢變平（此處為>20小時(shí)）。

　　3、管形成和血管生成分析的輸出參數(shù)

　　“管”一詞描述的是在二維網(wǎng)狀系統(tǒng)中可見(jiàn)的細(xì)胞索。具體來(lái)說(shuō)，這并不意味著細(xì)胞索有管腔。在管形成分析中，可以從相位對(duì)比圖像中確定四個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，如下圖所示。

　　• 細(xì)胞覆蓋面積[%] (藍(lán)色區(qū)域)

　　• 管長(zhǎng) [px] (紅線)

　　• 分支點(diǎn)數(shù) (白點(diǎn))

　　• 環(huán)路數(shù) (黃色數(shù)字)

　　這些關(guān)鍵參數(shù)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中顯示出相互一致的關(guān)系。因此，只需確定一個(gè)特征就足夠了：在本應(yīng)用說(shuō)明中，將只使用管的長(zhǎng)度作為管形成的代表性值。

　　相位圖像（A）和分析圖像（B）顯示了管形成分析的關(guān)鍵特征：細(xì)胞覆蓋面積（藍(lán)色）、管（紅色）、環(huán)路（黃色）和分支點(diǎn)（白色）。

　　根據(jù)這些參數(shù)，可以計(jì)算出其它值，如平均管長(zhǎng)、總管長(zhǎng)和環(huán)的平均面積。