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 　　血管形成實驗是一種簡單但功能強大的體外工具，用于篩選抗血管生成或促血管生成作用的物質(zhì)。這些影響可以通過不同的參數(shù)來測量，例如管的長度或凝膠表面形成的環(huán)的數(shù)量。

　　初始步驟通常涉及創(chuàng)建一個基底膜狀凝膠基質(zhì)作為生長區(qū)域(例如，通過使用Laminin-Collagen I或Matrigel®)。接下來，將細胞接種在固化的凝膠基質(zhì)上，然后進行孵育并使用光學(xué)顯微鏡采集圖像數(shù)據(jù)。隨著時間的推移，測量管的形成參數(shù)提供了有價值的數(shù)據(jù)，可以揭示添加抗血管生成或促血管生成物質(zhì)后管的形成特性的變化。

　　優(yōu)化成管分析的實驗方案和數(shù)據(jù)采集方法對于獲得可靠和可重復(fù)的數(shù)據(jù)至關(guān)重要，這是正確分析的先決條件。本應(yīng)用說明概述了重要的分析參數(shù)和規(guī)劃有效血管形成分析的指南。

　　1、規(guī)劃實驗

　　在開始管形成和血管生成分析之前，通過經(jīng)驗測試確定較優(yōu)的實驗設(shè)置至關(guān)重要。所選擇的系統(tǒng)應(yīng)與研究目標密切一致，并允許可行的數(shù)據(jù)收集。因此，建立嚴格的方案對于生成可重復(fù)和可比較的數(shù)據(jù)集至關(guān)重要。

　　在管形成和血管生成實驗中，關(guān)鍵因素包括細胞類型、細胞密度、生長培養(yǎng)基、凝膠基質(zhì)和數(shù)據(jù)采集時間點。這些因素將在接下來的章節(jié)中進一步討論。

　　在進行實驗之前，計算所需的材料，如培養(yǎng)基、凝膠基質(zhì)、物質(zhì)、實驗室器具和細胞數(shù)的數(shù)量。其他需要考慮的因素包括實驗室設(shè)備、空間要求和時間安排。每個實驗都應(yīng)該在相同的細胞培養(yǎng)和環(huán)境參數(shù)下進行。

　　為了進行可靠的統(tǒng)計分析，我們建議每種情況至少有4個數(shù)據(jù)點，每種情況至少有8個單獨的孔。這導(dǎo)致總共至少32個單獨的實驗。實驗的次數(shù)取決于數(shù)據(jù)的同質(zhì)性。在計算耗材、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理時間時，應(yīng)考慮這一點。

　　1.1 細胞類型和傳代次數(shù)

　　不同的細胞類型在大小、生長行為(擴散、加倍率)和對生長條件的要求上各不相同。例如，細胞大小決定細胞播種數(shù)以調(diào)整細胞密度。此外，生長培養(yǎng)基的成分可以影響促血管生成或抗血管生成作用。

　　此外，傳代次數(shù)(P)可以影響原代細胞的行為和功能，原代細胞通常用于管形成試驗。低傳代細胞(<P6)更具有生理相關(guān)性。然而，在較高的傳代中，細胞可能會經(jīng)歷增殖能力的喪失，基因表達的改變和形態(tài)的改變，會影響結(jié)果。

　　一個成熟可靠的實驗設(shè)置是使用低傳代(<P6)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，在不含生長因子和2%或更低血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中生長。

　　1.2 培養(yǎng)基成分

　　細胞培養(yǎng)基是管形成試驗中的一個重要因素，提供關(guān)鍵的營養(yǎng)物質(zhì)并影響細胞行為。選擇優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基可確保細胞健康，并能準確反映生物過程。生長因子濃度和血清含量等因素在這一選擇中至關(guān)重要。

　　在培養(yǎng)基中加入血清可能會影響管的形成行為——在大多數(shù)情況下，血清會抑制管的形成。為了避免這個問題，在實驗前應(yīng)使用1.3節(jié)中定義的優(yōu)質(zhì)細胞密度測試0-20%的不同血清濃度。這將決定管形成和細胞存活的優(yōu)質(zhì)血清濃度。

　　1.3 細胞密度

　　凝膠表面的細胞數(shù)量是獲得管形成試驗可靠結(jié)果的關(guān)鍵參數(shù)。要確定優(yōu)質(zhì)細胞播種密度，請記錄細胞系的特性。

　　首先，在 5–40 × 103個細胞/ml的范圍內(nèi)進行稀釋。然后將細胞接種到凝膠表面。接種后，開始以30分鐘的時間間隔記錄相位對比圖像。理想情況下，每個細胞濃度執(zhí)行3-5次重復(fù)。

　　按照第3節(jié)的描述對圖像進行評估。在這里，我們建議使用較常見的關(guān)鍵參數(shù)“總管長”。在您選擇的一個時間點(例如，4小時后)，在下圖中可視化細胞播種密度與管長度的關(guān)系。數(shù)據(jù)將顯示一個具有較大值的特征曲線，這是所使用細胞類型的優(yōu)質(zhì)播種密度。。此處所示的示例使用HUVEC，其優(yōu)質(zhì)播種密度為 10–20 × 103個細胞/ml。

HUVEC播種密度響應(yīng)的示例性。該圖顯示了在播種后4小時隨細胞播種密度變化的分析管長。

　　1.4 陽性和陰性對照

　　在管生成實驗中，結(jié)合控制對于獲得有意義、可靠的結(jié)果至關(guān)重要。

　　應(yīng)使用刺激管形成的陽性對照來建立對生物活性物質(zhì)反應(yīng)的參考值。為了建立陽性對照，選擇一個確保管形成的實驗環(huán)境(例如，用于HUVECs的Matrigel®低生長因子和無血清培養(yǎng)基)。陽性對照驗證細胞的生命狀況，并作為任何促血管生成或抗血管生成物質(zhì)的參考。陰性對照確保在細胞培養(yǎng)實驗中可以抑制管的形成。為了建立陰性對照，選擇一種被證明對管狀形成有抑制作用的物質(zhì)(例如，用于HUVECs的蘇拉明)。

　　1.5 凝膠基質(zhì)

　　用于管形成測定的凝膠用作基底膜樣（BM）表面，以模擬體外的自然條件。然而，凝膠的生化和機械性能顯著影響細胞行為，并影響管的形成。

　　用于管形成分析的先進凝膠是Matrigel®或Laminin膠原蛋白I凝膠。兩種凝膠都有各自的優(yōu)點和缺點，在規(guī)劃實驗時應(yīng)該考慮到這一點。

　　Matrigel®是一種從Engelbreth Holm Swarm小鼠肉瘤中提取的天然即用型BM溶液。然而，一個缺點是癌癥環(huán)境中生長因子的定義不清且成分可變。這導(dǎo)致不同批次之間的機械和生化性能波動，從而改變管的形成特性。因此，當使用Matrigel®時，所有實驗都應(yīng)使用同一批次的Matrigel®進行。

　　相比之下，雙組分層粘連蛋白-膠原I凝膠被認為具有更明確的基質(zhì)組成。但是，它并不包括BM的所有天然成分。

　　2、成像

　　成像在管形成分析中起著關(guān)鍵作用，因為它可以詳細觀察和分析血管生成效應(yīng)。通常，相差顯微鏡用于可視化細胞動力學(xué)，而不需要染色。管形成分析即可以作為時間序列進行，以確定形成的動態(tài)行為，也可以作為終點實驗，在一定時間后固定細胞進行成像。

　　2.1 選擇優(yōu)質(zhì)的物鏡

　　由于管的形成是在整個載玻片孔的表面區(qū)域，因此建議觀察盡可能大的視場角(FOV)建議，以獲得較大的信息量。FOV可以通過改變物鏡的放大倍數(shù)來改變——使用4x到10x物鏡的低放大倍率對于大多數(shù)管形成實驗來說是足夠的。

　　Tips：視場(FOV)與圖像分辨率間接相關(guān)。使用低倍率物鏡（2-10倍）將導(dǎo)致低分辨率的大視場。相比之下，使用高倍率物鏡(20倍或更高)將導(dǎo)致較低的視場，但具有較高的分辨率。

　　如果需要高分辨率的大視場，建議采集后對單幅圖像進行拼接掃描。

　　2.2 延時成像對于延時成像和活細胞成像，需要維持一個穩(wěn)定的生理環(huán)境，以確保細胞的自然行為，使用ibidi Stage Top Incubators可以實現(xiàn)這一點。在凝膠表面播種細胞后，立即將載玻片或培養(yǎng)皿置于顯微鏡上適當?shù)姆跤抑?，并開始時間序列。可能需要對每個時間步驟進行焦點調(diào)整，這可以手動或使用基于軟件的工具完成。

　　如果您的顯微鏡沒有孵育室，請在獲取圖像后立即將樣品放入細胞培養(yǎng)箱中。在這種情況下，盡量縮短成像時間（例如，盡量縮短培養(yǎng)箱和顯微鏡之間的距離），以避免樣品中的溫度波動。

　　在進行延時成像時，時間間隔和總成像時間取決于所使用的細胞系和實驗條件。例如，第一種方法可能是在24小時內(nèi)以15-30分鐘的時間步長進行成像。然后，應(yīng)該調(diào)整第一次實驗的時間序列參數(shù)，以找到較優(yōu)的時間步長。因此，通過可視化一個關(guān)鍵參數(shù)(例如，管總長度，見第3節(jié))與時間的關(guān)系來分析時間序列，如下圖所示。該參數(shù)的時間曲線與細胞有關(guān)，這里展示了在Matrigel®上生長的HUVEC細胞的示例。在這里，時間曲線通常上升到緩慢平坦(>20小時)。應(yīng)定義一個信號高且穩(wěn)定的時間點進行分析。在下面的例子中，當使用在Matrigel®上生長的HUVEC細胞時，建議的測量時間點在4到5小時之間。

　　在Matrigel®上以15分鐘的時間間隔生長超過24小時的HUVEC細胞的時間序列。這里，從每個時間步長計算出作為管形成代表參數(shù)的總管長度。該參數(shù)的曲線通常會上升到較大值（此處為~4小時），然后下降到平穩(wěn)階段（此處為~7小時后），逐漸緩慢變平（此處為>20小時）。

　　3、管形成和血管生成分析的輸出參數(shù)

　　“管”一詞描述的是在二維網(wǎng)狀系統(tǒng)中可見的細胞索。具體來說，這并不意味著細胞索有管腔。在管形成分析中，可以從相位對比圖像中確定四個關(guān)鍵參數(shù)，如下圖所示。

　　• 細胞覆蓋面積[%] (藍色區(qū)域)

　　• 管長 [px] (紅線)

　　• 分支點數(shù) (白點)

　　• 環(huán)路數(shù) (黃色數(shù)字)

　　這些關(guān)鍵參數(shù)在實驗過程中顯示出相互一致的關(guān)系。因此，只需確定一個特征就足夠了：在本應(yīng)用說明中，將只使用管的長度作為管形成的代表性值。

　　相位圖像（A）和分析圖像（B）顯示了管形成分析的關(guān)鍵特征：細胞覆蓋面積（藍色）、管（紅色）、環(huán)路（黃色）和分支點（白色）。

　　根據(jù)這些參數(shù)，可以計算出其它值，如平均管長、總管長和環(huán)的平均面積。