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　　這些術(shù)語經(jīng)常與高通量篩選(HTS)的基本概念一起被提及，高通量篩選采用龐大的自動化機(jī)器人系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，能夠測試數(shù)十萬到數(shù)百萬種化合物，從而有效縮小潛在候選藥物的范圍。在HTS的基礎(chǔ)上，高內(nèi)涵篩選(HCS)通過結(jié)合先進(jìn)的顯微鏡和成像技術(shù)，進(jìn)一步提高了這些能力，您可以測量許多不同的端點或輸出，而不是僅僅測量一個端點。

　　

　　本篇文章探討了高內(nèi)涵篩選（一個涵蓋高內(nèi)涵成像和高內(nèi)涵分析的總稱）如何通過捕獲顯示細(xì)胞對化合物反應(yīng)的表型數(shù)據(jù)來增強(qiáng)藥物研發(fā)過程。

　　

　　

　　高內(nèi)涵篩選的核心是高內(nèi)涵成像(HCI)，這是一種基于圖像的高通量方法，利用共聚焦顯微鏡、活細(xì)胞成像和自動多色熒光成像等顯微鏡技術(shù)。這種方法能夠詳細(xì)捕獲細(xì)胞樣本，從而同時分析2D和3D細(xì)胞培養(yǎng)中單個細(xì)胞的多個分子特征。從本質(zhì)上講，HCI提高了藥物發(fā)現(xiàn)中細(xì)胞分析的深度和準(zhǔn)確性，使科學(xué)家能夠從細(xì)胞對潛在治療化合物的反應(yīng)中獲得有價值的見解。以下是HCI在高內(nèi)涵篩選中的主要應(yīng)用：

　　

　　

　　通過提供詳細(xì)的可視化，HCI幫助研究人員設(shè)計可靠的檢測方法，可以準(zhǔn)確測量特定的生物過程或終點，例如與疾病相關(guān)的細(xì)胞檢測。這些檢測方法可提供精確的測量并監(jiān)測表型變化，從而有助于優(yōu)化早期發(fā)現(xiàn)工作。例如，高通量管形成檢測可作為一種體外工具，以簡單、經(jīng)濟(jì)高效且可重復(fù)的方式評估血管生成，從而利用細(xì)胞的管形成能力來分析各種藥物的促血管生成或抗血管生成潛力。同樣，傷口愈合和遷移檢測有助于分析不同條件下的細(xì)胞遷移，使其成為研究人員工具包中的寶貴補(bǔ)充。

　　

　　除此之外，HCI還使研究人員能夠生成既可預(yù)測又可轉(zhuǎn)化為體內(nèi)效應(yīng)的臨床前數(shù)據(jù)，尤其是與患者相關(guān)的3D類器官培養(yǎng)物相結(jié)合時。這種先進(jìn)成像技術(shù)與3D類器官模型之間的協(xié)同作用提高了臨床前評估的可靠性。

　　

　　

　　

　　ibidi憑借µ-Plate 96 Well 3D為高通量管形成和3D細(xì)胞培養(yǎng)分析提供了解決方案。它提供了出色的細(xì)胞可視化效果，無彎液面，從而確保了可重復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)條件。即用型Culture-Insert 2 Well 24非常適合可重復(fù)的高通量傷口愈合和遷移分析。它由已插入µ-Plate 24 Well 的具有明確無細(xì)胞間隙的硅膠Culture-Insert插件組成。

　　

　　2. 大規(guī)模轉(zhuǎn)染試驗

　　

　　HCI廣泛應(yīng)用于大規(guī)模轉(zhuǎn)染試驗，是評估基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系統(tǒng)的有效性和效果的重要工具。HCI能夠可視化和量化基因表達(dá)，使研究人員能夠微調(diào)轉(zhuǎn)染方案、了解基因功能并探索分子相互作用。

　　

　　

　　人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)衍生的神經(jīng)元用MAP2染色，MAP2是細(xì)胞體和近端樹突的標(biāo)記。神經(jīng)元通過神經(jīng)原素2誘導(dǎo)分化，并與小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)30天。每個方格都從ibidi µ-Plate 96孔方格的單獨孔中記錄。圖像記錄在具有10倍物鏡的高內(nèi)涵共聚焦成像系統(tǒng)上。圖片由美國馬薩諸塞州劍橋Q-State Biosciences, Inc. 的Chris Hempel提供。

　　

　　3. 化合物篩選

　　

　　通過HCI，研究人員可以仔細(xì)研究化合物對細(xì)胞行為各個方面的影響，包括細(xì)胞形態(tài)、蛋白質(zhì)表達(dá)和亞細(xì)胞定位等，所有這些都可以同時進(jìn)行評估。這種多方面的分析有助于精確定位具有所需特性的化合物，從而高效、準(zhǔn)確地推進(jìn)藥物研發(fā)工作。

　　

　　例如， Schuth等人進(jìn)行的研究強(qiáng)調(diào)了個性化PDAC共培養(yǎng)模型在全面分析藥物反應(yīng)和闡明導(dǎo)致腫瘤基質(zhì)介導(dǎo)化學(xué)耐藥性的分子機(jī)制方面的潛力。利用高內(nèi)涵成像技術(shù)有助于揭示共培養(yǎng)環(huán)境中這些復(fù)雜的相互作用，為PDAC病理生物學(xué)和治療策略提供寶貴見解。

　　

　　

　　PDAC-PDO單一培養(yǎng)和PDAC-PDO/CAF共培養(yǎng)的已建立藥物測試工作流程示意圖

　　

　　

　　HCI已成為毒性研究的基石，可用于評估潛在藥物化合物或環(huán)境因素的安全性。它有助于監(jiān)測細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和其他毒理學(xué)終點，從而能夠識別可能對細(xì)胞或組織造成風(fēng)險的化合物或條件。

　　

　　對于高內(nèi)涵成像(HCI)來說，至關(guān)重要的是，板的底部必須既薄又平，以促進(jìn)成像所需的光傳輸。在使用板進(jìn)行HCI之前，研究人員需要驗證它是否符合成像質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　

　　

　　

　　圖左為：標(biāo)準(zhǔn)96孔板底部由聚苯乙烯制成，厚度為1毫米，不適合高分辨率或熒光顯微鏡。

　　

　　圖右為：ibidi96孔板帶有平坦的ibidi聚合物蓋玻片 #1.5底部(180µm,+10/-5µm)，非常適合高分辨率或熒光顯微鏡。

　　

　　ibidi提供專門設(shè)計的微量滴定板，旨在滿足這些應(yīng)用的嚴(yán)格要求。ibidi的板有黑色方形和圓形孔，底部平坦、透明，可確保最佳成像質(zhì)量。它們配有#1.5 ibidi聚合物蓋玻片（µ-Plate 96孔方形孔和µ-Plate 96孔圓形孔）或#1.5H玻璃蓋玻片底部（µ-Plate 96孔方形孔玻璃底、µ-Plate 96孔圓形孔玻璃底和µ-Plate 384孔玻璃底）

　　

　　

　　HCI非常適合活細(xì)胞分析，能夠?qū)崟r監(jiān)測動態(tài)細(xì)胞過程。它有助于研究細(xì)胞行為，例如細(xì)胞遷移、細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件。HCI使得研究人員能夠捕獲延時圖像并跟蹤長時間內(nèi)細(xì)胞表型的變化，為細(xì)胞動力學(xué)和對刺激的反應(yīng)提供有價值的見解。

　　

　　

　　ibidi提供Stage Top加熱孵育系統(tǒng)系統(tǒng)/活細(xì)胞工作站，用于使用具有ANSI/SLAS(SBS)標(biāo)準(zhǔn)格式的微孔板進(jìn)行高通量活細(xì)胞成像。該系統(tǒng)可在倒置顯微鏡上輕松進(jìn)行活細(xì)胞成像，精確控制溫度、濕度、CO2 和O2。

　　

　　

　　高內(nèi)涵分析是指利用自動化圖像分析軟件對高內(nèi)涵篩選產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。HCA可以分析圖像中每個細(xì)胞的多個參數(shù)，每次實驗處理數(shù)千個細(xì)胞。這包括對細(xì)胞形狀、體積、質(zhì)地和熒光強(qiáng)度在一系列波長范圍內(nèi)的變化進(jìn)行量化。HCA已經(jīng)發(fā)展到包括多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如3D球體和共培養(yǎng)，以及多路復(fù)用能力，從而能夠同時監(jiān)測每個孔中單個微環(huán)境中的各種特征。

　　

　　

　　高內(nèi)涵篩選的工作流程

　　

　　

　　近期HCS發(fā)展的一個主要趨勢之一是機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能(AI)的集成。這些技術(shù)增強(qiáng)了HCS系統(tǒng)的分析能力，使其能夠識別細(xì)胞圖像中的模式和特征，這些模式和特征對于傳統(tǒng)的分析方法來說可能過于微妙或復(fù)雜。例如，機(jī)器學(xué)習(xí)算法正被用于提高圖像分析的準(zhǔn)確性和速度，包括自動分類細(xì)胞類型、量化表型變化和預(yù)測細(xì)胞對不同處理的反應(yīng)的能力。

　　

　　另一個重要趨勢是成像技術(shù)本身的進(jìn)步。人們一直在努力開發(fā)更高分辨率和更快的成像系統(tǒng)，以便實時捕捉詳細(xì)的細(xì)胞動態(tài)。超分辨率顯微鏡技術(shù)現(xiàn)在更頻繁地與HCS平臺配對，為細(xì)胞的分子機(jī)制提供了前所未有的見解。此外，多光譜成像技術(shù)允許同時檢測多個熒光標(biāo)記，從而促進(jìn)對細(xì)胞相互作用和功能的復(fù)雜研究。

　　

　　HCS的應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大，它能夠處理的生物復(fù)雜性也越來越大。最近的創(chuàng)新推動了能夠分析多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)的發(fā)展，例如類器官和3D細(xì)胞培養(yǎng)。這些3D培養(yǎng)物可以更好地模擬人體內(nèi)細(xì)胞的自然環(huán)境，為篩選藥物和了解疾病機(jī)制提供了新的方法，與臨床結(jié)果有更高的相關(guān)性。

　　

　　

　　Schuth, S., Le Blanc, S., Krieger, T.G. et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res 41, 312 (2022).