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　　本實(shí)驗(yàn)描述了將斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)嵌入低百分比低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行延時(shí)顯微鏡觀察的過(guò)程。根據(jù)科學(xué)問(wèn)題，可以在瓊脂糖嵌入的幼蟲(chóng)中觀察不同的發(fā)育階段：這可以包括在卵殼內(nèi)的最初48小時(shí)的發(fā)育，或孵化后的時(shí)間（受精后48-120小時(shí)）。

　　

　　1.相關(guān)文件

　　

　　• µ-Slide 2 Well Co-Culture的使用說(shuō)明書(shū)

　　

　　2.材料和試劑

　　

　　2.1.動(dòng)物

　　

　　• 斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)（受精后最長(zhǎng)達(dá)120小時(shí)）

　　

　　2.2.緩沖液和溶液

　　

　　魚(yú)類(lèi)水（60倍）

　　

　　• 172克氯化鈉（ROTH，P029.2）

　　

　　• 7.6克氯化鉀（ROTH，6781.1）

　　

　　• 29克CaCl2 x 2 H2O（ROTH，CN92.2）

　　

　　• 49克MgSO4 x 7 H2O（ROTH，P027.1）

　　

　　• 加入脫離水達(dá)到10升

　　

　　魚(yú)類(lèi)水（1倍）

　　

　　• 160毫升魚(yú)類(lèi)水（60倍）

　　

　　• 20毫升0.01％（w / v）亞甲藍(lán)（Sigma-Aldrich，M9140）在去離子水中

　　

　　• 加入脫離水達(dá)到10升

　　

　　Tricaine儲(chǔ)備溶液

　　

　　• 4 g / l Tricaine / MS-222（Sigma Aldrich，A5040）

　　

　　• 0.02 M三氯甲烷（ROTH，4855.2），pH 9

　　

　　• 在去離子水中

　　

　　Tricaine使用溶液

　　

　　• 在魚(yú)類(lèi)水（1倍）中稀釋Tricaine儲(chǔ)備溶液，以最終濃度為160毫克/升（1:25）

　　

　　0.5% 低熔點(diǎn)瓊脂(LMPA)

　　

　　• 可以批量制備并分成小份用于每個(gè)實(shí)驗(yàn)

　　

　　• 在微波爐中將0.5%（w/v）低熔點(diǎn)瓊脂（Biozym, 840101）與魚(yú)水（1x）一起煮沸，直到瓊脂完全溶解

　　

　　• 讓瓊脂冷卻到約35°C左右

　　

　　• 添加Tricaine庫(kù)存溶液，最終濃度為80 mg/L（1:50）

　　

　　最終的低熔點(diǎn)瓊脂濃度可以調(diào)整。例如，我們成功地使用了高達(dá)2%的低熔點(diǎn)瓊脂，但決定使用0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗惶赡苡绊懮磉^(guò)程。

　　

　　2.3.設(shè)備

　　

　　

(ibidi, 81806)

　　

　　• 熱混合器 (例如，Eppendorf，ThermoMixer C)

　　

　　• µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，ibiTreat底部處理 (ibidi, 81806)

　　

　　• 塑料移液管

　　

　　• 可選: 小刷子

　　

　　• 顯微鏡

　　

　　3.實(shí)驗(yàn)步驟

　　

　　準(zhǔn)備工作

　　

　　在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，按照“緩沖液和溶液”部分的描述準(zhǔn)備LMPA。保持在35°C，直到需要使用。如果瓊脂已經(jīng)提前準(zhǔn)備好，可以在熱混合器中重新加熱 (~80°C)，然后讓瓊脂冷卻 (~35°C)。

　　

　　裝載

　　

　　在使用µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片之前，請(qǐng)先閱讀說(shuō)明書(shū)。

　　

　　在我們小組的某些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)斑馬魚(yú)脊髓進(jìn)行了機(jī)械性損傷。如果這樣做，建議請(qǐng)?jiān)谘b載前讓幼魚(yú)恢復(fù)至少30分鐘。在脊髓橫切后，嵌入瓊脂的初始存活率為80%。這些幼魚(yú)在瓊脂中觀察48小時(shí)后也都存活了。未受傷的幼魚(yú)的初始存活率接近100%。

　　

　　1. 使用三氯甲烷使用溶液麻醉斑馬魚(yú)幼魚(yú)2分鐘。

　　

　　2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片的每個(gè)孔中放置一只幼魚(yú)，并使用一些多余的魚(yú)水。

　　

　　3. 對(duì)每只幼魚(yú)單獨(dú)執(zhí)行以下步驟（以避免變干）：

　　

　　3.1. 使用塑料移液管除去所有魚(yú)水。

　　

　　3.2. 向小孔中加入50µl LMPA，以覆蓋幼魚(yú)。

　　

　　3.3. 使用刷子或小的移液管頭將幼魚(yú)定位到適當(dāng)?shù)奈恢茫▊?cè)面位置，盡可能水平和直立，具有統(tǒng)一的對(duì)準(zhǔn)，即始終向左，卵黃在底部）。

　　

　　4. 讓LMPA凝膠固化（0.5%凝膠約需20-30分鐘）。

　　

　　5. 可選：用包含80mg / L三氯甲烷庫(kù)存溶液的1x魚(yú)水覆蓋固化的LMPA凝膠，以進(jìn)行連續(xù)成像的麻醉。

　　

　　6. 用自帶的蓋子蓋住µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，以避免蒸發(fā)。

　　

　　7. 斑馬魚(yú)幼魚(yú)已經(jīng)上樣好準(zhǔn)備成像

　　

　　在48小時(shí)的成像期間，如果蓋子緊閉，則無(wú)需在瓊脂上方加入魚(yú)水，因?yàn)闃?biāo)本不會(huì)變干。這也使得可以進(jìn)行正置顯微鏡觀察，而不必?fù)?dān)心灑出來(lái)。

　　

　　

　　圖1：斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器。

　　

　　延時(shí)顯微鏡觀察

　　

　　這種樣品制備方法被用于連續(xù)延時(shí)顯微鏡，以及使用德累斯頓技術(shù)大學(xué)CRTD的核心設(shè)施——光學(xué)顯微鏡設(shè)施的各種顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)拍攝某些視場(chǎng)的快照。 這包括倒置和正置，廣角和共聚焦顯微鏡。

　　

　　

圖2：A）斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)受精后72小時(shí)，埋入瓊脂3小時(shí)后的整個(gè)µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器的亮場(chǎng)瓦片掃描，共有18條幼魚(yú)。

　　

　　視頻：此示例顯示了一個(gè)短20分鐘的三維時(shí)間軸的Z投影，顯示了受機(jī)械性脊髓切斷處理的轉(zhuǎn)基因mpeg1:mCherry斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)受精后3天的情況。熒光標(biāo)記的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞和微膠質(zhì)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)間軸是用Dragonfly旋轉(zhuǎn)盤(pán)顯微鏡（Andor）獲取的。請(qǐng)見(jiàn)如下視頻：