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　　細胞生物學是生命科學的一門學科。顧名思義，它致力于研究生物。單憑這一事實就足以成為研究細胞自然生存狀態(tài)的理由。當然，活細胞成像還有其他深層次的原因。在本篇文章中，我們列舉了用延時顯微鏡研究活細胞是有意義的五大很好的理由。

　　背景

　　活細胞成像允許在一定時間內(nèi)在顯微鏡下對細胞進行體內(nèi)觀察。各種顯微鏡技術(shù)適用于活細胞成像：例如，可以采用無標記的技術(shù)，如相差，DIC，或干涉測量法，也可以依靠熒光顯微鏡，利用熒光標記標記和可視化細胞亞結(jié)構(gòu)、分子或蛋白質(zhì)。當然，活細胞成像也面臨挑戰(zhàn)，在建立活細胞圖像實驗時需要考慮某些要求。最重要的是，必須確保顯微鏡配備了一個stage top 培養(yǎng)箱，能夠提供理想的環(huán)境，使細胞在一段時間內(nèi)保持存活和健康。

圖1.A：活細胞成像過程中需要考慮和控制的環(huán)境參數(shù)

圖1.B：倒置顯微鏡的臺頂培養(yǎng)箱示意圖

　　參數(shù)和環(huán)境條件是此類實驗的重要部分，我們將在以后的公眾號中討論。如果您有興趣，可以在本篇文章中查看更多相關(guān)內(nèi)容。在此我們已經(jīng)介紹了基本知識，接下來我們將繼續(xù)深入探討為什么您應該使用活細胞成像來研究您的細胞：

　　1.避免固定過程中的人工制品

　　細胞通常在顯微鏡觀察前固定（如免疫熒光），以保存在逼真的狀態(tài)。多年來，許多不同的化學和物理程序已被優(yōu)化和建立，以保持原始樣品的質(zhì)量。然而，固定過程會對細胞造成損害（當然在這個過程之后，它們會死亡），并不可逆轉(zhuǎn)地改變其組織、結(jié)構(gòu)和形態(tài)（細胞器收縮、蛋白質(zhì)定位錯誤等）。然而，活細胞成像可以讓我們研究活細胞。這意味著他們應該展示他們的自然形態(tài)，這仍然會受到熒光標簽、激光等的影響，但這就像環(huán)境條件一樣，是一個不同的狀況。

　　2.觀察和分析動態(tài)過程

　　活細胞成像使我們能夠觀察整個細胞群、單個細胞甚至亞細胞水平的動態(tài)事件。當固定細胞將其鎖定在特定時間點的特定（行為或結(jié)構(gòu)）狀態(tài)時，對活細胞的顯微鏡觀察可以洞察整個動態(tài)過程。基于功能性細胞的檢測，如損傷和遷移（圖2）或趨化實驗是活細胞成像應用的很好的例子。這些分析使得研究細胞對化學（趨化性）或機械（傷口愈合）刺激的反應成為可能。

圖2：使用ibidi Stage Top孵育系統(tǒng)的活細胞成像顯示了傷口愈合和遷移試驗中MCF7細胞的間隙閉合。相差；10倍物鏡。

　　3.實時跟蹤細胞變化

　　活細胞顯微鏡是實時了解細胞隨時空變化的一種有價值的方法，而不是依賴于固定細胞的端點的分析結(jié)果。通過使用延時視頻顯微鏡對細胞進行更長時間的跟蹤，可以捕捉到結(jié)構(gòu)重排的動態(tài)(如圖3，感受趨化刺激后細胞骨架的極化), 或使用固定細胞可能會錯過的瞬時細胞性活動(如，有絲分裂期間的染色體分離)。

圖3：應用趨化梯度后，表達LifeAct的原代樹突狀小鼠細胞中肌動蛋白動力學的活細胞成像

　　4. 研究單分子動力學、定位和相互作用

　　先進熒光標記和成像技術(shù)的發(fā)展，如光脫色熒光恢復技術(shù)（FRAP）、熒光壽命成像顯微技術(shù)（FLIM）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET），使活細胞成像過程中單分子定位、動力學和相互作用的觀察和分析成為可能。

　　FRAP可以測量活細胞內(nèi)熒光標記分子和蛋白質(zhì)的遷移率。FLIM通過測量附著的熒光團的壽命來提供有關(guān)細胞分子分布及其環(huán)境的信息。

　　利用FRET，人們可以通過檢測兩個分子在納米級相互接近時所附熒光團的相互作用來測量活細胞中兩個分子的直接相互作用。

　　5. 從單個實驗中獲取更多信息

　　總的來說，如果您進行活細胞成像，您可以從單個實驗中獲得比從固定細胞成像更多的信息。這是因為活細胞成像使人們能夠跟蹤分子動力學和動力學，并提供了您感興趣的一個更大、更全面的細胞過程圖像。

　　對固定樣本的分析通常只提供某個細胞性活動的快照，而跟蹤整個動態(tài)過程使人們能夠從單個實驗中測量更多參數(shù)，并得出更多不同的結(jié)論。

　　如您有興趣了解更多關(guān)于活細胞成像的知識，請關(guān)注我們公眾號活細胞成像應用相關(guān)內(nèi)容。也可以向我們索要相關(guān)資料。

　　活細胞成像應用相關(guān)內(nèi)容：

實時研究生物過程                            活細胞成像參數(shù)

                 活細胞成像實驗的要求與設(shè)置                          實驗示例