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　　AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

　　為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細(xì)胞的運動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。這種2D侵襲方案是一種共培養(yǎng)試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）組成的。一旦兩種細(xì)胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細(xì)胞單層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，在我們的研究中，我們在模擬實體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的條件，例如與基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）的相互作用以及成纖維細(xì)胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細(xì)胞系和真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行了此測定。黑色素瘤細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞，繼而維持腫瘤細(xì)胞的生長，惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗癌化合物后，我們發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞直接接觸的黑素瘤細(xì)胞顯示出運動能力受損并且未能侵襲成纖維細(xì)胞層。

　　材料和試劑

　　1. GFP-A375細(xì)胞系（ATCC）

　　2. 番茄皮成纖維細(xì)胞（從健康患者中分離）

　　3. MEF細(xì)胞培養(yǎng)基

　　4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

　　5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

　　6. 臺盼藍(lán)溶液（Sigma-Aldrich;93595）

　　7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最終濃度下使用

　　8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm濃度下使用，用DMSO稀釋

　　儀器設(shè)備

　　1. 層流凈化罩

　　2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

　　3. 臺式離心機(jī)

　　4. 細(xì)胞計數(shù)器

　　5. 2孔插件（ibidi: 80209）/預(yù)置2孔插件培養(yǎng)皿（ibidi:81176）

　　6.細(xì)胞培養(yǎng)管

　　7. 渦旋

　　8. 鑷子

　　9. 光學(xué)顯微鏡

　　10. 熒光顯微鏡

　　11. NIS-Elements軟件

ibidi:81176

　　實驗流程

　　01. 將GFP-A375和番茄成纖維細(xì)胞系穩(wěn)定地保存在MEF培養(yǎng)基中，在37°C和5%C02加濕培養(yǎng)箱中。

　　02. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們，以去除死細(xì)胞和碎片。

　　03. 在培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細(xì)胞約5分鐘，然后添加MEF培養(yǎng)基以阻止反應(yīng)。

　　04. 將細(xì)胞懸浮液收集在15ml細(xì)胞培養(yǎng)管中，并用臺式離心機(jī)（1500xg,5´,RT）短暫離心。

　　05. 將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中；將一體積的細(xì)胞懸液與另一體積的臺盼藍(lán)溶液混合，用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)活細(xì)胞。

　　06. 在MEF緩沖液中以4x105細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞。

　　07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養(yǎng)插件）。

　　08. 用75µl（3x104細(xì)胞）FP-A375細(xì)胞填充插入物一側(cè)，并用番茄成纖維細(xì)胞填充另一側(cè)。用移液器上下混合插入物中的細(xì)胞，以確保細(xì)胞完全分布。

　　09. 將多孔板放在培養(yǎng)箱中，放置過夜。

　　10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養(yǎng)基和插件，并用PBS清洗。

　　11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養(yǎng)基。

　　12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細(xì)胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)。

　　13. 一旦每個孔中的間隙完全閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細(xì)胞尚未侵入成纖維細(xì)胞單層。

　　14. 小心地除去培養(yǎng)基，并在控制組孔中添加培養(yǎng)基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養(yǎng)基+300nM絲裂霉素A。將板放在培養(yǎng)箱中24小時（處理孵育時間）。

　　24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養(yǎng)孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細(xì)胞散布在紅色標(biāo)記層上）的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的任何變化（圖2）。

圖1：2D侵襲系統(tǒng)的示意圖

圖2：2D侵襲檢測的熒光圖像

　　將黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細(xì)胞層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。A375細(xì)胞顯示出大規(guī)模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。

　　備注：

　　1.此處描述了MEF培養(yǎng)基組成（參考文獻(xiàn)1）。

　　2.此文僅供參考。

　　3.此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯(lián)系本文作者。

　　參考文獻(xiàn)：

　　1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

　　2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

　　3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k